0 引言
大腸桿菌，學名大腸埃希氏菌，是人和動物腸道中最主要且數量最多的一種細菌，主要寄生在大腸內。若此菌在水和食品中檢出，可能是由于糞便污染，表示其中可能有腸道病原菌，因此，對大腸桿菌的檢測常作為重要衛生學標準之一。此外，部分致病性大腸桿菌侵入人體后可引起感染，有關食品中存在大腸桿菌導致人員中毒的現象屢見不鮮，如2013年在云南曾暴發因冷凍肉感染大腸桿菌而導致人員中毒事件2016年食堂工作人員攜帶非典型致病性大腸桿菌所造成食品污染導致26名小學生食源性疾病暴發事件。國外也同樣出現了大腸桿菌危害食品安全的現象。1982—2002年美國曾有多例食源性大腸桿菌污染事件發生，其中有7例與乳制品相關。乳制品中大腸菌群的污染占有很大比例，在2016—2018年和2019年前三季度我國乳制品微生物項目監督抽檢中，大腸菌群超標最為嚴重，其中發酵乳占有很大的比例。大腸桿菌具有一定的耐酸性，酸奶及乳飲料被其污染可能會影響產品質量，危害人類食品安全，監測大腸桿菌在產品中的檢出及變化情況至關重要。
因此，本文模擬生產中產品污染大腸桿菌的情況，向酸奶及乳飲料中接種大腸桿菌，監控其在不同pH、儲藏溫度條件下，儲藏過程中菌含量變化及pH的變化情況，為實際生產加工過程中產品冷藏及脫冷條件下大腸桿菌的檢驗檢測和產品質量控制提供理論依據和理論指導。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
菌株為大腸埃希氏菌ATCC 25922。
1.1.2 試劑
結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、營養肉湯培養基；氯化鈉。
1.1.3 儀器與設備
BSC1500IIA2-X生物安全柜；FE28-TRIS pH計；HVM1渦旋儀；JJ1000A電子天平；BSP-250生化培養箱；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋。
1.2 方法
1.2.1 菌種活化
取保存于-80℃冰箱中磁珠管中的大腸桿菌標準菌株，取1粒磁珠轉接至營養肉湯中，37℃培養24 h，活化三代后備用。
1.2.2 樣品制備
(1）樣品中不同濃度大腸桿菌在不同儲藏溫度下含量的變化
選取酸奶（250 g/瓶），乳飲料（300 mL/瓶）各16瓶，先將活化后菌液（1.2.1）用無菌生理鹽水梯度稀釋至103 CFU/mL和105 CFU/mL兩個梯度，再將稀釋后菌液接種至酸奶、乳飲料中使其菌含量約為10 CFU/mL和103 CFU/mL。以上接種后樣品分別儲藏于4℃和25℃兩個溫度條件下，定期測定樣品中大腸桿菌含量變化。
(2）接種大腸桿菌驗證在不同儲藏條件下含量變化
市售酸奶pH范圍一般為4.2～4.5，乳飲料為3.0～4.0，本試驗酸奶的初始pH為4.2，乳飲料為3.6，因此，分別調節酸奶及乳飲料的pH為4.2和3.6兩個組，然后無菌操作向樣品中接種大腸桿菌至樣品中菌含量約為103 CFU/mL，分別儲藏于4℃和25℃條件下，測定樣品中大腸桿菌含量變化及樣品pH的變化情況。根據不同的儲藏條件及pH分為以下四個組。
表1 樣品的pH及儲藏溫度
(3）不同pH營養肉湯對大腸桿菌含量的影響
在通常情況下營養肉湯培養基溶解后pH為7.5，本次試驗調節初始營養肉湯培養基的pH分別為3.2,3.4,3.6,3.8,4.0,4.2,4.4,4.6,4.8，取1 mL大腸桿菌菌液分別接種到100 mL的營養肉湯管中，置于（36±1）℃培養箱中培養，定期測定大腸桿菌含量。
1.2.3 大腸桿菌含量測定
本試驗采用《GB 4789.3—2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》中第二法測定樣品中大腸桿菌含量。
1.2.4 pH測定
采用校準后的pH計測定儲藏過程中酸奶及乳飲料及營養肉湯培養基的pH。
2 結果與分析
2.1 酸奶及乳飲料中不同濃度大腸桿菌儲藏后變化情況
通過向酸奶及乳飲料中接種低（10 CFU/mL，高（103 CFU/mL）兩個梯度的大腸桿菌，模擬實際生產中產品低溫儲藏（4℃）及可能遇到的常溫脫冷（25℃）的情況，探究酸奶及乳飲料中大腸桿菌隨時間延長的含量變化情況。結果如表2所示，乳飲料在不同初始接菌量和不同儲藏溫度條件下，儲藏16天后菌含量均降低至無法檢出。酸奶樣品儲藏在4℃仍還有大腸桿菌存活，且高梯度中剩余量高達268 CFU/mL，但在25℃條件下儲藏，無論是接種高梯度還是低梯度的大腸桿菌，樣品中大腸桿菌含量均降低至無法檢出（表2）。
造成以上差異的原因可能是由于溫度適宜，乳酸菌產生抗菌物質，或者乳酸菌發酵產酸導致樣品pH降低。從表中結果表明，大腸桿菌降低至無法檢出的樣品均為低pH的樣品。因此，低pH可能對大腸桿菌的活性造成較大的影響。
2.2 不同pH對酸奶中大腸桿菌的影響
基于2.1的結果，即酸奶和乳飲料在儲藏過程中大腸桿菌的存活情況不同的現象，進一步對其原因進行探究。經測定，酸奶初始pH為4.2。由圖1a中可以看出，隨著儲藏時間的增加，pH4.2的酸奶樣品在25℃條件下儲藏pH不斷降低，而在4℃條件下儲藏pH基本保持不變。pH為3.6酸奶樣品不管是在4℃和25℃儲藏pH基本保持不變。
圖1b顯示出，儲藏過程中，A條件下的酸奶中大腸桿菌整體呈現相對緩慢降低趨勢，B,C,D條件下含量呈現減少趨勢，降低速率較快。低pH酸奶（B,D）樣品中菌均在儲藏4天后降低至無法檢出，C條件下儲藏6天后降低至無法檢出。相同儲藏溫度條件下，pH低的酸奶中大腸桿菌含量減少的更快，表明pH對大腸桿菌的活性造成了較大的影響。當酸奶pH為4.2時，冷藏（4℃）條件下，大腸桿菌及乳酸菌活性均受到抑制，乳酸菌在儲藏過程中未進行明顯的發酵產酸，酸奶在整個儲藏過程中pH基本不變，因此大腸桿菌降低速率緩慢，儲藏15天后仍有菌檢出，為57 CFU/g，超出發酵乳三級采樣最高安全限量值5 CFU/g，而在25℃儲藏的酸奶中乳酸菌在相對適宜條件下，繁殖發酵產酸，導致儲藏過程中酸奶pH明顯降低至3.8，這可能對大腸桿菌產生了較大的影響，其降低速率明顯高于低溫儲藏的酸奶樣品，但在這其中乳酸菌也可能造成了一定的影響。當酸奶pH為3.6時，不同儲藏溫度間降低速率相差不大，由此可見，pH對酸奶中大腸桿菌的影響更為明顯。
圖1 酸奶在儲藏過程中的大腸桿菌菌含量（a）及pH(b）的變化情況
表2 不同產品在不同儲藏溫度條件下大腸桿菌含量及pH的變化情況
2.3 不同p H對乳飲料中大腸桿菌的影響
乳飲料初始pH為3.6,A條件下儲藏的乳飲料pH基本不變，而25℃儲藏過程中pH降低，可降到3.4。與酸奶不同的是在pH 3.6的低pH下，25℃儲藏乳飲料的pH持續降低，這可能是由于酸奶與乳飲料中乳酸菌菌種不同造成的。乳飲料中為更耐酸性的菌種，乳酸菌繼續發酵產酸導致pH持續降低。（圖2b）與酸奶相同，A條件下的乳飲料中大腸桿菌含量先略有增加后降低，可能是由于大腸桿菌對低溫具有一定的抗性，隨時間延長，不利于其生長，菌含量明顯降低，其他條件下乳飲料中的大腸桿菌含量隨著儲藏時間延長而減少，B、C、D條件下的乳飲料分別在儲藏10,6,4天后，大腸桿菌的量降低至無法檢出，且樣品pH分別為3.6,3.7,3.5，而A條件下的乳飲料直至儲藏15天后仍有菌存活，為28 CFU/mL。圖2a中可以看出，儲藏溫度越高，pH低的乳飲料中菌含量降低的越快。儲藏溫度及pH均對大腸桿菌的活性造成了一定的影響。
2.4 pH對大腸桿菌生長的影響驗證
大腸桿菌對酸性具有一定的抗性，但相對更低的pH也會對大腸桿菌的活性造成影響。有文獻報道大腸桿菌最低培養溫度為7℃左右，適合生長的最低pH為4左右。表中為pH不同的培養基中大腸桿菌在培養過程中的變化情況。
當pH>3.8時，隨著培養時間的延長大腸桿菌生長繁殖，菌含量增加，而當pH≤3.8時，隨著培養時間的延長大腸桿菌活性受到抑制，菌含量逐漸降低，由此可見較低的pH對大腸桿菌造成了一定的影響。乳飲料的pH相對酸奶更低，因此，對大腸桿菌活性造成了抑制，加速了大腸桿菌的失活，低溫條件下，正常乳飲料（pH 3.6）在儲藏6天后菌含量降低為2 CFU/mL，隨時間延長，第10天降低至無法檢出，而酸奶（pH 4.2）在儲藏15天仍有菌檢出（圖1a，圖2a）。
3 結果與討論
產品中大腸菌群污染控制對于消費者的食品安全來說至關重要，因此了解大腸桿菌污染產品后隨著儲藏時間及條件改變的變化規律具有重大意義。為了保障酸奶及乳飲料的品質，一般低溫冷藏（4℃）保存，但當在出廠運輸等過程中可能會出現脫冷的情況，因此研究保質期內產品中感染大腸桿菌后的變化情況具有重要意義。低pH明顯加速大腸桿菌的衰亡，儲藏溫度及pH均對產品造成了一定的影響，但儲藏溫度對產品中大腸桿菌的影響可能是由于溫度升高產品中乳酸菌發酵，pH降低導致的。當產品在運輸、銷售等過程中發生脫冷時，通常認為大腸桿菌可能繁殖，發酵產酸產氣導致產品脹包，然而本試驗過程中，產品中大腸桿菌并未增加，25℃儲藏的酸奶及乳飲料在整個儲藏期間均未發生脹包現象，相反pH降低加速大腸桿菌的滅亡。大腸桿菌在不同pH培養基中的生長狀態，再次證明了pH對大腸桿菌的影響。這對于生產中實際檢驗檢測具有一定的指導意義。大腸菌群作為生產過程衛生指示菌，對其的控制非常重要。由于pH對大腸菌群的影響，檢測成品可能并不能代表真實情況，需要及時進行檢驗檢測。因此，為了更好控制食品安全，對于酸奶類產品建議在發酵前或者成品灌裝后及時檢測。
圖2 乳飲料在儲藏過程中的菌含量（a）及pH(b）的變化情況
表3 pH不同培養基中大腸桿菌隨培養時間延長的變化情況
